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直接培养法检测细胞培养中的支原体污染

特点

最直接最灵敏的检测手段。

缺点

培养时间长,需3-5周才能判断。有些支原体不能在培养基上培养出来(例如M. hyorhinis)。需要同时培养支原体菌株作阳性对照,可能会造成污染。

材料

葡萄糖、L-盐酸精氨酸、Difco PPLO broth(Difco 0554-17-1)、马血清、15%酵母膏溶液(高压灭菌)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(高压灭菌)、无菌培养皿(60x15mm)、玻璃棒、37℃培养箱、厌氧缸(厌氧缸长期培养易有污染,所以厌氧包应该用无菌水,每次打开厌氧缸后用70%酒精擦拭内壁。)

培养基准备: 基本配方为Difco PPLO broth(60%),马血清(20%),15%酵母膏溶液(10%),10x储存液(10%)。由于培养时间长,可加50u/ml青霉素至10x储存液或加入乙酸铊(1:2000)至培养基中以防止其他细菌的污染。

10x储存液(1升): 称取50克葡萄糖,10克L-盐酸精氨酸溶于1升蒸馏水中。用0.22μm无菌过滤膜过滤除菌,分装100ml至瓶中,-70℃保存。

液体培养基(1升): 称取21克Difco PPLO broth,0.02克酚红于600ml蒸馏水中加热搅拌溶解。灭菌121℃15分钟灭菌。待温度降低至室温后于无菌操作台内加入200ml马血清,100ml 15%酵母膏溶液及100ml解冻的10x储存液,混合均匀后分装至已灭菌的有盖螺旋试管中,10ml/管。4℃保存,保存期限为1个月。

固体培养基: 称取21克Difco PPLO broth,0.02克酚红,15克Bacto agar于600ml蒸馏水中,加热溶解。121℃15分钟灭菌,放入50℃水浴中,待温度降至50℃时于无菌超净台内加入200ml马血清,100ml 15%酵母膏溶液及解冻的10x储存液,混合均匀后倒入60x15mm无菌培养皿中,5ml/皿。保存于4℃,期限为1个月。

步骤

取1ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液接种于液体培养基中,置于37℃培养2周,观察是否有浑浊或pH变化。培养一周及两周后,分别取0.1ml液体培养液涂于琼脂平板上,倒置于厌氧缸中,37℃培养至少3周,持续观察是否有支原体菌落出现。

另取1ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液涂于琼脂平板上,37℃厌氧培养3周,持续观察是否有支原体菌落出现。

另作正负对照组,正对照为Acholeplasma laidlawii(ATCC 23206)与M. arginini(ATCC 23838)。负对照组为待测细胞的新鲜培养液。

结果判断

支原体生长较慢,所以先在液体培养基中培养1-2周增殖后再培养于琼脂平板上,至少培养3周后才能断定是否有支原体污染。所以总个测试要5周才知道正确结果。

典型的支原体菌落是荷包蛋形,是由于支原体网琼脂下层生长所致,为无色透明菌落,大小约为10-55μm 。但是并非所有支原体都是荷包蛋菌落,有些是圆形或类似黏菌类形态。

区分细胞或是气泡造成的类似菌落,可将其自琼脂平板上切下,重新培养于液体培养基中,培养一周后再接种入琼脂平板,细胞和菌落则不会生长。

* 本文内容主要来自台湾国家卫生研究院细胞库