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PCR法测细胞培养的支原体污染

PCR法测细胞培养的支原体污染

原理

利用特殊专一性的引物,经PCR反应来复制支原体DNA。所用的引物来自支原体的保守16S-23S的rRNA序列,由于这段spacer的序列随支原体种类不同而不同,因此可依所复制的DNA大小及其特异性片段的大小来作检测及鉴定。

特点

灵敏及快速,可检测到不易培养的支原体,不必培养支原体作阴阳性对照,避免可能带来的污染。

缺点

PCR反应很灵敏,容易带来假阳性结果,仅能作为参考。

材料与设备:

ATCC支原体检测试剂盒(可作50-100个反应,提供第一阶段引物混合物与第二阶段引物混合物,有DNA阳性对照(A. laidlawii, M. pirum)),PCR反应试剂(Taq聚合酶,dNTP,10xPCR buffer,25mM 氯化镁,PCR水),PCR仪,琼脂糖胶电泳设备,手套,无菌PCR反应管,无菌1.5ml微量离心管,无菌2ul、20ul、200ul、1000ul枪头。

引物序列

  • 第一阶段引物混合物:1. ACACCATGGGAG(C/T)TGGTAAT,2. CTTC(A/T)TCGACTT(C/T)CAGACCCAAGGCAT,3. AAAGTGGGCAATACCCACGC,4. TCACGCTTAGATGCTTTCAGCG
  • 第二阶段引物混合物:1. GTG(C/G)GG(A/C)TGGATCACCTCCT,2. GCATCCACCA(A/T)A(A/T)AC(C/T)CTT,3. CCACTGTGTGCCCTTTGTTCCT

操作过程

  1. 第一阶段的PCR反应:加样品2ul(直接取待测细胞培养液、支原体DNA(+)、PCR水(-)),10x buffer(含1.5mM氯化镁)2.5ul,第一阶段引物混合物0.5ul,dNTP(1.25mM each)1.0ul,氯化镁(25mM)0.5ul,Taq DNA 聚合酶(5U/ul)0.1ul,PCR水18.4ul至PCR管,混匀,放入PCR仪反应。
  2. PCR 反应(第一阶段与第二阶段同):94℃变性(30秒),94℃(30秒)、55℃(2分钟)、72℃(2分)30循环,72℃延伸(5分钟),4℃保存
  3. 第二阶段PCR反应:加样品1ul(第一阶段产物),10x buffer(含1.5mM氯化镁)2.5ul,第一阶段引物混合物0.5ul,dNTP(1.25mM each)1.0ul,氯化镁(25mM)0.5ul,Taq DNA 聚合酶(5U/ul)0.1ul,PCR水19.4ul至PCR管,混匀,放入PCR仪反应,反应程序同2。
  4. 琼脂糖凝胶电泳:2.0%琼脂糖凝胶(含EB),1xTAE电泳缓冲液,选择100-500bp DNA marker,第二阶段反应产物各取10ul加入2ul loading dye(6x),电泳分离(100V,25分钟),紫外灯下观察并照相记录。

结果判断

不同种支原体第二阶段PCR得到的片段大小为:

M. arginini 236bp, M. fermentas 365bp, M. hominis 236bp, M. hyorhinis 315bp, M.oral 290bp,M. pirum 323bp, M. salivarium 269bp, M. laidlawii 426bp+219bp(电泳结果参见左上图)。

* 本文内容主要来自台湾国家卫生研究院细胞库